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| 目的 无翅型MMTV整合位点家族成员16 (WNT16)是一种重要的信号调节蛋白，参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株，并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法 使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体，将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体，构建慢病毒载体质粒；将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞，制备携带WNT16基因的慢病毒；利用慢病毒感染HEK 293T细胞，并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株；利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白，使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果；用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞，使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平，以评估WNT16蛋白的活性。结果 成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体，并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定，我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白，并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后，我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞，并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平，WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达，表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论 本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化，并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。 |
| 关键词: WNT16 HEK 293T细胞 过表达 稳转细胞株 纯化 HIS标签 |
| DOI：10.16252/j.cnki.issn1004-0501-2023.12.001 |
| 分类号:R329.2 |
| 基金项目:成都市科技局课题(编号:2019-GH02-00006-HZ)； |
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